La inmunotinción - inmunofluorescencia

inmunofluorescencia es una técnica utilizada para microscopía de luz con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en muestras microbiológicas. Esta técnica utiliza la especificidad de los anticuerpos a su antígeno para apuntar colorantes fluorescentes a los objetivos específicos de biomoléculas dentro de una célula, y por lo tanto permite la visualización de la distribución de la molécula objetivo a través de la muestra. La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente usado de inmunotinción y es un ejemplo específico de inmunohistoquímica que hace uso de fluoróforos para visualizar la localización de los anticuerpos.

inmunofluorescencia se puede utilizar en secciones de tejido, líneas celulares cultivadas, o células individuales , y puede ser utilizado para analizar la distribución de las proteínas, glicanos, y pequeñas moléculas biológicas y no biológicas. Inmunofluorescencia se puede utilizar en combinación con otros métodos, que no son anticuerpos de tinción fluorescente, por ejemplo, el uso de DAPI para etiquetar ADN. Varios diseños de microscopio se pueden utilizar para el análisis de muestras de inmunofluorescencia; el más simple es el microscopio de epifluorescencia y al microscopio confocal es también ampliamente utilizado. Varios diseños de microscopio super-resolución que son capaces de una resolución mucho mayor también se pueden utilizar.

La disciplina de Immunoflourescene ha desarrollado de manera similar a la inmunohistoquímica. El uso de autoanticuerpos se detectaron por primera vez hace muchos años en secciones congeladas de ratón y de rata hígado. Las muestras se preparan generalmente en el laboratorio, y los otros reactivos necesarios, tales como conjugados, eran raramente disponibles a las concentraciones óptimas requeridas para los sistemas de prueba de diagnóstico individuales. Por lo tanto se encontraron resultados autoinmunes primeros a ser muy variable. El uso de diferentes sustratos para la detección de autoanticuerpos mostró que los autoanticuerpos contra los componentes nucleares, tales como los contra el ADN de doble cadena, los anticuerpos anti-dsDNA, que exhibió un patrón de inmunofluorescencia homogénea, eran fácilmente detectable en las secciones de hígado.

Tres componentes de un microscopio de fluorescencia que son diferentes de un microscopio de luz se enumeran en la tabla siguiente. Estas partes del microscopio se muestran en las fotos de abajo y cómo encajan con el resto de las estructuras. Todos los filtros son dentro de un cubo de filtro

Estas partes del microscopio se muestran en la imagen de abajo y cómo encajan con el resto de las estructuras. Todos los filtros son dentro de un cubo de filtro

La disciplina de Immunoflourescene ha desarrollado de manera similar a la inmunohistoquímica. El uso de autoanticuerpos se detectaron por primera vez hace muchos años en secciones congeladas de ratón y de rata hígado. Las muestras se preparan generalmente en el laboratorio, y los otros reactivos necesarios, tales como conjugados, eran raramente disponibles a las concentraciones óptimas requeridas para los sistemas de prueba de diagnóstico individuales. Por lo tanto se encontraron resultados autoinmunes primeros a ser muy variable. El uso de diferentes sustratos para la detección de autoanticuerpos mostró que los autoanticuerpos contra los componentes nucleares, tales como los contra el ADN de doble cadena, los anticuerpos anti-dsDNA, que exhibió un patrón de inmunofluorescencia homogénea, eran fácilmente detectable en las secciones de hígado.

inmunofluorescencia se puede llevar a cabo utilizando dos tipos diferentes de manchas. Hay ventajas y desventajas para ambas las técnicas que se muestran a continuación.

técnica de inmunofluorescencia directa tiene varias ventajas sobre el protocolo secundario (o indirecta). Uno de estos es debido a la conjugación directa del anticuerpo al fluoróforo. El menor número de pasos en el procedimiento de tinción significa que el proceso es más rápido y reduce la señal de fondo, evitando cualquier anticuerpo de reactividad cruzada o no especificidad. Una desventaja es que el número de moléculas fluorescentes que se pueden unir al anticuerpo primario está limitada, inmunofluorescencia directa es menos sensible que la inmunofluorescencia indirecta

La inmunofluorescencia indirecta sin embargo utiliza dos anticuerpos -. La etiqueta primer anticuerpo se une específicamente a la molécula diana y un anticuerpo secundario que lleva el fluoróforo. Esto reconoce el anticuerpo primario y se une a ella.

anticuerpos secundarios múltiples pueden obligar a un único anticuerpo primario. Esto proporciona amplificación de la señal mediante el aumento del número de moléculas de fluoróforo por antígeno. Este protocolo es más complejo y consume mucho tiempo que el protocolo directa, pero permite mayor flexibilidad debido a una variedad de diferentes anticuerpos secundarios y técnicas de detección se puede utilizar para un anticuerpo primario dado.