Immunocytochemistry

 La inmunohistoquímica o IHC se refiere al proceso de detección de antígenos en las células de una sección de tejido. Esto se lleva a cabo mediante la explotación del principio de anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos en los tejidos biológicos.

La tinción inmunohistoquímica se utiliza ampliamente en el diagnóstico de tumores cancerosos de linfoma de Hodgkins a la diferenciación de diferentes tumores por ejemplo, carcinoma ductal de la mama basado en la tinción de antígeno específico. Marcadores moleculares específicos son característicos de determinados acontecimientos celulares tales como la proliferación o muerte celular apoptosis. IHC es también ampliamente utilizado en la investigación básica para entender la distribución y localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico. Visualizar una interacción anticuerpo-antígeno se puede lograr en un número de maneras. En el caso más común, un anticuerpo está conjugado con una enzima, tal como peroxidasa , que pueden catalizar y hacer que el área visible.

La disciplina de inmunohistoquímica o inmunocitoquímica se conoce desde la década de 1930, pero fue realmente hizo posible sólo en 1942 cuando el primer estudio IHC fue reportado por Coons. Aquí él utiliza anticuerpos marcados con FITC para identificar neumocócica antígenos en el tejido infectado. Desde entonces, se han realizado mejoras en la conjugación de proteínas, métodos de fijación de tejido, las etiquetas de detección y microscopía, haciendo inmunohistoquímica de rutina y una herramienta esencial en los laboratorios de diagnóstico y de investigación.

La digestión proteolítica es la descomposición hidrolítica de las proteínas en sustancias solubles simples, tales como péptidos y aminoácidos. Este método de recuperación de antígeno utiliza enzimas para descomponer los enlaces cruzados de proteínas creadas durante la fijación con formalina del tejido. Este proceso puede utilizar varios tipos diferentes de enzimas como pronasa, tripsina, así como varios otros.

Esta técnica tiene la ventaja de que las enzimas que trabajan a temperaturas más bajas pueden ser utilizados, lo que potencialmente se desnaturalizó a las temperaturas más altas utilizadas en la recuperación de antígeno mediada por calor. Sin embargo, una desventaja de esta técnica es que las enzimas, en particular tripsina pueden terminar destruyendo algunos epítopos además de afectar a la morfología del tejido y por lo que las enzimas requieren una vigilancia cuidadosa y la puesta del momento óptimo de incubación y la concentración para reducir estos problemas.

calor Olla de presión mediada por la recuperación de antígeno consiste en la aplicación de calor con tampón citrato para desenmascarar el antígeno. Esto implica el uso de una olla a presión para entre 1-5 minutos para calentar las diapositivas, que están fijados como se muestra a continuación.

Imagen 1 - Diapositivas en olla a presión

 

Antígenos olla a presión tienen la ventaja sobre la digestión de la proteasa en que el mecanismo está mediado de calor, por lo que no implica las desventajas que participan en la digestión de la proteasa. También la olla a presión es fácil de usar y requiere menos tiempo que el uso de microondas calor mediada por la recuperación de antígenos y las secciones se les da tratamiento de calentamiento iguales, inconsistencia en la tinción debido a los puntos calientes y fríos que pueden ocurrir durante el tratamiento de microondas no se experimenta cuando se utiliza una olla a presión. Sin embargo, una desventaja de esta técnica es los riesgos de salud y de seguridad adicionales que plantea al personal por la alta temperatura requerida, por ejemplo lesiones por quemaduras. También el potencial para el tejido a ser destruido por el horno es otra desventaja de este procedimiento.

La recuperación de antígenos de microondas ha demostrado ser eficaz en el desenmascaramiento de epítopos en fijadas con formalina, tejidos embebidos en cera de parafina. Este procedimiento como se muestra abajo, similar al método olla a presión utiliza el calor para recuperar antígenos de tejido normalmente fijadas con formalina.

Imagen 2 - Diapositivas en el horno microondas
 

Las diapositivas son normalmente deparaffinized en xileno y luego llevado al agua a través del alcohol y el espíritu. Después de que los portaobjetos se sumergieron en tampón. Después de que están a continuación, calentados en esta solución. Después, los portaobjetos se lavaron en PBS, después de enfriar antes de ir a procedimiento normal IHC.

Uno de los problemas con la recuperación de antígenos de microondas es que puede ser difícil de controlar con precisión la temperatura de calentamiento del horno de microondas. Esto, sin embargo, se pueden superar mediante un microondas científica que calentará uniformemente todos los ámbitos a la misma temperatura.

Para llevar a cabo el procedimiento del protocolo general que se utiliza a continuación se siguen, Secciones cortan a las 3mm y flotaba en portaobjetos de vidrio Superfrost. Secciones se drenan y luego a la izquierda en la incubadora 56C durante una hora o en la sala de temperatura durante la noche.

1        Secciones Desparafinar parafina en xileno - 5 mins. (para las secciones de resina, De-resina de xileno durante la noche)

2        Enjuague través de alcoholes graduados al agua - 5 minutos en cada.

3        Lave en agua - 5 minutos

4        Bloque con 3% de peróxido de hidrógeno acuoso - 10 minutos

5        Lave en agua - 5 minutos

6        Aplicar antígeno de recuperación en su caso:

a)     Microondas a máxima potencia en CC1 - 2 x 10 minutos Recuerde recargar nivel de líquido después de los primeros 10 minutos.

b)     O aplicar Pronasa 1 reactivo para el momento adecuado en la cámara de humedad.

7        Lavar con agua corriente fría y dejar enfriar - 5 minutos

8        Lavar con tampón de reacción y aplicar Dako Pen alrededor de las secciones

9        Coloque las secciones en el cuadro de la humedad.

10   Aplicar anticuerpo primario prediluido suficiente para cubrir las secciones durante el tiempo apropiado.

11   Enjuague con Tampón de Reacción - 2 x 5 minutos

12   Aplique el polímero Enlace (Universal HRP multımero) - 30 minutos

13   Enjuague con Tampón de Reacción - 2 x 5 minutos

14   Aplicar Universal DAB cromógeno, (2 - 3 gotas)

15   Añadir la misma cantidad de H2O2 universal DAB, (2 - 3 gotas) para activar el cromógeno

16   Visualizar al microscopio para determinar la tinción óptima. Entonces lavar bien con agua.

18   Contratinción ligeramente en hematoxilina durante unos 15 segundos, y luegoLave bien con agua a las secciones azules-up

19   Mejorar la tinción mediante la colocación de los portaobjetos en 0,5% acuoso CuSO4 durante 10 minutos

20   Lave en agua. Deshidratar través de alcoholes graduados y claras en xileno; montar en la CV montaje.

Positividad-Brown tinción

Imagen - P53 detectado en la tinción inmunohistoquímica en el cáncer colorrectal

IHC tiene una amplia gama de anticuerpos que se utilizan para ayudar en muchas áreas, desde la determinación de diagnóstico de tumores.

El anticuerpo	Tipo de tinción y dónde expresado	¿Por qué	Control Normal
Bcl-2	La tinción citoplasmática. Normalmente expresada por pequeños linfocitos B del manto y de zonas marginales y por muchas células T.	Es útil como marcador de linfoma folicular	amígdalas
Bcl-6	Nuclear tinción proliferación marcador, Es exclusivamente presente en las células B centros geminales.	Útil para demostrar tanto la hiperplasia reactiva en los ganglios linfáticos y una variedad de linfoma derivado de células B foliculares por ejemplo Burkitt	amígdalas
Bob1	tinción nuclear, las células B	marcador útil para la determinación de B origen lympohoma celular como restringida a B lympohcytes.	amígdalas
C4D	La tinción citoplasmática Memranous, cavidades peritubblar	Es útil para determinar si un trasplante de riñón será rechazada	nodo Lmyph, rechazó aguda del riñón o de amígdalas
Ca-125	membranosa citoplasmática, ovarios	Es útil para la determinación de cáncer de ovario	El carcinoma de ovario
La calcitonina	citoplasmática	Útil para demostrar células productoras de calcitonina en la tiroides, ayudar en el diagnóstico de los tumores de la tiroides.	El carcinoma medular de tiroides
Caldesmon	citoplasmática	Es útil en el diagnóstico de los tumores del músculo liso, también en differntion de algunos tumores de ovario	apéndice o el pecho

IHC tiene una amplia gama de anticuerpos que se utilizan para ayudar en muchas áreas, desde la determinación de diagnóstico de tumores. A continuación se presentan algunos ejemplos.

El anticuerpo	¿Dónde expresado	¿Por qué	Control Normal
CD2	citoplasmática y membranosa, marcador de células T	útil como marcador de células T normales. Pan T marcador muy útil en el diagnóstico de linfoma y leucemia de células.	amígdalas
CD3	membranosa, marcador de células T	marcador útil de origen Tcell para el diagnóstico del linfoma	amígdalas
CD4	membranosa citoplasmática, marcador de células T	Útil para demostrar los linfomas de células T	amígdalas
CD8	membranosas, marcador de células citotóxicas T	Se encuentra en muchas células asesinas naturales, buenos para el seguimiento de ciertas neoplasias. Muy útil cuando se utiliza con CD4 en el panel para distinguir las células T auxiliares de periféricos linfomas de células T	amígdalas
CD10	membranosa Cytoplamsic, marcador de células T	proliferación CD10 positivo difuso de linfocitos en una localización extranodal también proporciona una evidencia muy fuerte de apoyo en favor de linfoma. También se puede utilizar para distinguir entre ductal y carcinomas de células basales	amígdalas, placenta, riñón
CD20	Las células B	Es útil para distinguir entre las neoplasias de células B que está presente y T neoplasia origen célula en la que está ausente.	amígdalas
Chromogranin	citoplasmática, Islotes de langerham en el páncreas	Es útil en el diagnóstico de las condiciones neuroendocrinos ejemplo adenomas hipofisarios	Páncreas
CK AE1 / 3	citoplasmática	ventajosa en la detección de metástasis en los ganglios linfáticos y para distinguir entre el carcinoma epitelial y tumores no epitehlial	colon, próstata, mama, piel
TTF1	tinción nuclear útil en tumores de pulmón	Puede distuinguish entre adenocarcinomas primarios y metastásicos de pulmón	Control de pulmón